Иммуногистохимическое исследование матки


Гистологическое исследование. Материал биоптатов и соскобов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине. Дальнейшая обработка производилась по стандартной общепринятой унифицированной методике. Тканевые образцы подвергали спиртовой проводке в гистопроцессоре ТР 1020, по длинной программе в течение 23 часов, которая включала: один 10% нейтральный формалин – 2,5 часа, два спирта 75° по 2,5 часа, два спирта 80° по 2 часа, три ксилола по 1,5 часа, один парафин 2 часа, два парафина по 2,5 часа. Заливка в парафиновые блоки проводилась на заливочном центре EG 1160. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах RM 2135 и RM 2235 и окрашивали гематоксилином и эозином. Все вышеперечисленное оборудование – фирмы «Leica Microsystems» (Германия). Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличениях от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Н.И. Кондриков 2008; Rosai J., 2004; Mazur M.T., Kurman R.J., 2005; Crum C.P., Lee K.L., 2006), и с учетом требований Международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ 10).


Иммуногистохимическое исследование. ИГХ реакции проводили в ступенчатых парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом с демаскировкой антигенов в СВЧ-печи. Для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit («Dako», США). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной и кроличьей сывороткой (нормальный мышиный и кроличий иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам (ЭР) (клон 1D5 «Dako», США) и прогестероновым рецепторам (ПР) (клон 1А6 «Dako», США), к эстрогеновым рецепторам (ЭР) (клон PPG5/10 «Diagnostic BioSystems» США), к фактору пролиферации – белку Кi67 (клон MIB 1 «Dako», США), а так же антитела к белкам Р27 и Cyklin E, регулирующим клеточный цикл (клоны – DCS-72.F6 и HE12, соответственно, «Diagnostic BioSystems» США).

Электронномикроскопическое исследование. Для изучения поверхностной ультраструктуры в сканирующем электронном микроскопе отдельные фрагменты эндометрия фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. Проводили дегидратацию в растворе ацетона, сушку с СО2 в аппарате «Quorum Technologies» (Англия). Поверхность напыляли золотом в аппарате «Eiko» (Япония) Исследование проводили в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S 500 (Япония). Исследование проводили совместно с сотрудниками отдела электронной микроскопии НИИ Морфологии человека РАМН.


Количественная обработка материала. Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили под увеличением объектива х400, в участках соскобов и биоптатов с преобладающими диагностическими проявлениями. ИГХ реакция в строме оценивалась только в ее резидентных клетках. Интенсивность ИГХ реакции к ЭР, ЭР и к ПР в ядрах клеток эпителия желез и стромы оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле – S=1a+2b+3c, где а – % слабо окрашенных ядер клеток, b – % умеренно окрашенных ядер клеток, с – % сильно окрашенных ядер клеток (McClelland R.A. et al., 1991). Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 баллов – отсутствие экспрессии, 11-100 – слабая экспрессия, 101-200 – умеренная экспрессия, 201-300 – выраженная экспрессия. Применение счета H-score по отношению к экспрессии ЭР, по имеющимся у нас сведениям, было выполнено впервые. Интенсивность ИГХ реакции к белку Ki67 оценивали в процентах (количество окрашенных ядер на 100 клеток). Интенсивность реакции к белкам Р27 и циклину E оценивали в баллах – 1+ — слабая, 2+ — умеренная, 3+ — выраженная и в процентах (количество окрашенных ядер или цитоплазмы на 100 клеток). Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием системы статистического анализа «Statistica v6.0» и программы «Excel».


исательная статистика включала подсчет среднего значения (М) и стандартной ошибки среднего (м), достоверность определяли по методу Стьюдента с использованием формулы t=M1-M2/м1 +м2 (р<0,05), рассчитывали коэффициент вариации по формуле CV=/M. Проводили корреляционный анализ, при котором показатель корреляции менее 0,4 считали не значимым и не учитывали, если коэффициент был равен 0,4 — 0,5 – корреляционная связь считалась слабой, от 0,5 до 0,7 – средней, от 0,7 и выше – сильной (Г.Г. Автандилов, 1973).

Результаты исследования и их обсуждение.

Исследование эндометрия в группе сравнения показало, что в период 7-10 ПОД у обследованных женщин существовало открытое «окно имплантации». Это, в первую очередь, подтверждают соответствующие данному периоду МЦ секреторные проявления, обнаруженные при гистологическом исследовании. Уровень экспрессии ЭР в железах и в строме низкий (63,2+6,7 H-score), экспрессия ПР в железах эндометрия умеренная (132,5+9,5 H-score), в строме – выраженная (208,8+11,6 H-score). Пролиферативная активность клеток эпителия желез крайне низкая, в строме – слабая. Локализация Р27 и циклина Е в ядрах свидетельствует о блокировке клеточного цикла во всех клетках желез и в большей части клеток стромы. Наличие циклина Е в цитоплазме части клеток стромы свидетельствует о еще продолжающейся активности клеточного цикла. Так как, по общепринятым представлениям, именно строма играет важную роль в процессах имплантации и развития беременности, протекающие в части ее клеток процессы роста и дифференцировки вполне логичны.


том, что строма поддерживается в активном состоянии на протяжении всего «окна имплантации», свидетельствуют также высокий уровень в ней ПР и наличие слабой пролиферативной активности. Развитые пиноподии на поверхности эндометрия также отражают существование открытого «окна имплантации» у обследованных женщин группы сравнения.

По некоторым официальным статистическим данным эндометриальная патология, как первопричина бесплодия, составляет всего 3,2% (Crum C.P., Hornstein M.D., 2006). В тоже время, патология эндометрия была обнаружена нами у всех обследованных пациенток с бесплодием. Это выглядит парадоксальным только на первый взгляд. В работе представлен материал биоптатов и соскобов эндометрия, которые выполнялись только по строгим клиническим показаниям, основными из которых являлись – подозрение на патологию эндометрия или цервикального канала, нарушения менструального цикла. Таким образом, был изучен лишь определенный «пласт» пациенток, обратившихся в отделение ВРТ. Охватить спектр патологии у всех бесплодных женщин практически невозможно, структура и частота патологии эндометрия в нем неизбежно будет отличаться от выявленной нами. Но, в любом случае, процент ее среди бесплодных женщин высок. Патология эндометрия может и не быть первоначальной причиной бесплодия, но она всегда принимает роль значимого самостоятельного фактора, дополняет и усугубляет первопричины заболевания.


На основании данных объективного, инструментального и лабораторного обследования пациентки были разделены на подгруппы по принципу первичного и вторичного бесплодия и факторов бесплодия (рис.1). Это деление считается общепринятым в гинекологической практике (Назаренко Т.А. и др. 2004; И.В. Корнеева, Т.П. Лопатина, 2006), несмотря на его определенную условность из-за сочетания разных факторов у многих женщин с бесплодием. Т-пФ считали основным при отсутствии маточных труб или их непроходимости, подтвержденной данными гистеросальпингографии, хромосальпингоскопии. ЭФ выделяли в связи с синдромом склерокистозных яичников, гиперпролактинемией, снижением овариального резерва, что было подтверждено данными инструментальных и лабораторных исследований при отсутствии патологии матки и маточных труб. Эндометриоз, выявленный при помощи гистероскопии и лапароскопии, считали основной причиной бесплодия при исключении (или минимальных проявлениях) другой патологии.

Рисунок 1. Диаграмма. Распределение пациенток на группы с различными факторами при первичном и вторичном бесплодии.

Иммуногистохимическое исследование матки

При Б1 по сравнению с Б2 преобладали пациентки с ЭФ и эндометриозом (в сумме 58%), в то же время при Б2 67% составили пациентки с Т-пФ.

Средняя продолжительность бесплодия была наиболее высокой у женщин с эндокринным фактором, а наиболее низкой – при трубно-перитонеальном.


и изучении экстрагенитальных заболеваний в анамнезе обращает на себя внимание высокая частота перенесенных вирусных и бактериальных инфекций не только в детском, но и в старшем возрасте, причем практически без различий во всех подгруппах. Что, несомненно, могло сыграть важную роль в патогенезе бесплодия. Из соматических заболеваний у пациенток с Б1 преобладали заболевания органов дыхания и остеохондроз, а заболеваниями желудочно-кишечного тракта чаще страдали больные с Б2. Ожирение закономерно встречалось чаще у пациенток с ЭФ. При Т-пФ в анамнезе более частой была патология органов дыхания и мочевыводящей системы. Изучение спектра гинекологических заболеваний в анамнезе и при объективном обследовании выявило закономерные особенности в подгруппах. Инфекции и воспалительные заболевания значительно преобладали у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Такие заболевания как миома и патология шейки матки чаще встречались у пациенток с бесплодием, обусловленным эндометриозом. Очевидной выглядит высокая частота оперативных вмешательств на внутренних половых органах в группе с Т-пФ. Однако частота операций на других органах не имела различий у обследованных пациенток. Так же не имел существенных отличий в подгруппах средний возраст становления менархе, продолжительность менструального кровотечения и длительность МЦ. Беременности в анамнезе имели 34 пациентки, более половины из них (55,9%) – только одну. Искусственные аборты и самопроизвольные выкидыши наиболее частыми были у больных эндометриозом.

ематочные беременности были у 10 пациенток, 9 из них страдали трубно-перитонеальным бесплодием. 68,1% обследованных нами женщин имели ранее неудачные попытки лечения методами ВРТ в разных клиниках. В основном, ВРТ использовали пациентки с Б1 и Т-пФ. В качестве метода ВРТ чаще использовалось ЭКО. Обращает на себя внимание, что исследование гормонального профиля не показало существенных отличий в подгруппах. Средние показатели сывороточных гормонов в основном находились в пределах референсных значений. Незначительные отклонения в показателях сывороточного эстрадиола обнаружены у 4 пациенток (3 из них с Т-пФ), прогестерона – у 12 (6 из них с ЭФ). Причем достоверных отличий в спектре гистологически выявляемой патологии эндометрия, экспрессии стероидных рецепторов, фактора пролиферации и белков, регулирующих клеточный цикл, у этих женщин не обнаружено.

Анализ клинических данных показал определенные различия между подгруппами. Однако клинико-лабораторные показатели были с одной стороны очень разнообразными и разнородными, а с другой – повторялись и пересекались у многих пациенток различных групп.

Спектр патологии эндометрия при Б1 и Б2 представлял, естественно, одни и те же нозологические формы, но с рядом отличий по их частоте (рис.2).

Недостаточность лютеиновой фазы (НЛФ) была преобладающим типом патологии в группе с Б1 и превосходила по частоте встречаемости НЛФ при Б2.


стологически НЛФ проявлялась отставанием секреторных изменений в железах в среднем на 5 дней. В то же время, при Б2 по сравнению с Б1 на ведущей позиции оказываются полипы (ПЭ) и гиперплазия эндометрия (ГЭ). ГЭ имела вид простой неактивной очаговой гиперплазии, а ПЭ имели «классические» опорные диагностические признаки. Такие различия в спектре патологии выглядят вполне логично, учитывая разные по частоте причины бесплодия при Б1 и Б2 (рис.2). Это наиболее четко видно при разделении пациенток на группы с различными факторами бесплодия.

Рисунок 2. Диаграмма. Спектр патологии эндометрия при различных видах и факторах бесплодия.

Иммуногистохимическое исследование матки

Спектр патологии эндометрия при различных факторах бесплодия существенно различался (рис.2). Так при Т-пФ преобладали ПЭ и ГЭ. При эндометриозе, по сравнению с другими группами, ведущей была НЛФ, а при ЭФ преобладал ХЭ. Эти отличия могут быть объяснены тем, что Т-пФ и эндометриоз в той или иной степени сопровождаются эндокринными нарушениями, но они не оказываются основными в патогенезе бесплодия, а ЭФ, являясь основным ведущим, в анамнезе заболевания неоднократно подвергался гормональной коррекции.

Новые аспекты открываются при исследовании спектра патологии при различных факторах бесплодия у пациенток с Б1 и Б2. У пациенток с Т-пФ НЛФ преобладала при Б1 (35%), а ГЭ – при Б2 (29,2%), ХЭ и ПЭ обнаруживались с одинаковой частотой и при Б1 и при Б2.


пациенток с ЭФ ПЭ выявлялись только при Б1, НЛФ преобладала при Б1 (37,5%), а ХЭ значительно преобладал при Б2 (50%). В группе с эндометриозом ГЭ и ХЭ выявлены только при сочетании с Б1, а НЛФ и ПЭ преобладали при сочетании с Б2 (55,5% НЛФ и 44,4% ПЭ). В группах с Т-пФ и ЭФ вполне логичным оказывается преобладание НЛФ при Б1, а при эндометриозе НЛФ преобладала при Б2, что является вполне объяснимым и, в некоторой степени, отражает эндокринные нарушения при эндометриозе, не зависящие от типа бесплодия.

Стероидная рецептивность эндометрия при бесплодии существенно изменена. Эти изменения проявлялись и при Б1, и при Б2 в достоверном снижении количества ПР в стромальных клетках и достоверно повышенной экспрессией ЭР и в клетках желез, и в клетках стромы. Достоверных отличий в показателях H-score ЭР и ПР между Б1 и Б2 не обнаружено. И общая картина показателей в целом похожа. Однако уровни ПР и ЭР в железах имели тенденцию к несколько более высоким показателям при Б 2 по сравнению с Б1, а в строме – к более низким (табл.1).

Таблица 1. Рецепторы к эстрогенам () и прогестерону в эндометрии женщин с бесплодием, H-score. М+м.


ПР в железах

ПР в строме

ЭР в железах

ЭР в строме

Норма (n=30)

132,5+9,5

208,8+11,6

63,2+6,7

89,8+4,1

Б1 и Б2 (n=72)

139,3+8,2

183,1+5,7

149,7+8,3*

121,9+6,7*

Б1 (n=38)

131,5+11,0

187,3+6,8

141,7+11,9*

126,6+9,4*

Б2 (n=34)

148,1+12,3

176,9+9,0*

158,6+11,4*

116,8+9,7*

Т-пФ (n=39)

150,6+11,5

179,8+8,9*

157,6+11,2*

123,6+9,6*

ЭФ (n=17)

136,1+15,7

190,6+8,9

130,4+18,6*

129,2+13,9*

Эндометриоз (n=16)

115,3+16,9

180,0+8,5*

150,9+16,0*

110,3+12,8

Т-пФ приБ1(n=16)

140,3+17,4

186,8+11,4

161,9+17,6*

Источник: xn--d1acjmiy6ee.xn--p1ai

Добрый день!

 

Прокомментируйте пожалуйста результаты ИГХ и гистологии

 

Сделали на 21день МЦ,. в цикле 27-28 дней

 

Гистологическое исследование: в присланном материале эндометрий средней стадии фазы секреции с отставанием в развитии стромы.

 

ИГХ исследование:

ER в железах эндометрия — неравномерно от 5 до 0

ER в строме э — неравномерно от 10 до 0

PR в железах э — неравномерно от 3 до 0

PR в строме э — неравномерно от 270 до 70

 

CD8 в строме э — очагово расположенные клетки с умеренно выраженной экспрессией, до 18-25 клеток в п.з. (норма до 10 клеток в п.з. х400)

 

CD 20 в строме э — очагово расположенные клетки с умеренно выраженной ядерной экспрессией, до 8-10 клеток в п.з. (норма до 3 клеток в п.з. х400)

 

CD 4 в строме э — диффузно расположенные клетки с умеренно выраженной экспрессией, до 2-3 клеток в п.з. (норма до 10 клеток в п.з. х400)

 

CD 138 в строме э — отрицательная реакция (норма отриц. или единич.кл в п.з.)

 

Заключение:

По совокупности данных гистологического и ИГХ исследований с оценкой количества и соотношения рецепторов эстрогена и прогестерона в железах и строме, эндометрий в средней стадии фазы секреции с признаками умеренно выраженного хронического эндометрита с увеличением количества цитотоксических Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в железах и стромальном компоненте соответствует концу средней — началу поздней стадии фазы секреции.

 

 

 

 

Была на консультации у двух врачей: один врач сказал, что есть хр. эндометрит (который нужно пролечить перед ЭКО), и что рецепторы в норме.

Другой по поводу рецепторов сомневается, и говорит, что такой хр.энд-т есть у каждой второй и лечить его не нужно.

 

подскажите на ваш профессиональный взгляд, каково состояние рецепторного аппарата? возьмут ли на ЭКО с таким эндометрием? насколько «опасен» хр.энд-т и отставание в развитии стромы?

 

Благодарю вас! Спасибо!!!

Источник: www.ya-zdorova.ru

Какие задачи в онкологии помогает решать иммуногистохимия?

Иммуногистохимический анализ помогает врачам-онкологам:

  • Отнести злокачественную опухоль к тому или иному типу.
  • Выяснить, в каких генах опухолевых клеток произошли мутации, какие белки способствуют прогрессированию рака.
  • Выявить первичную опухоль и ее метастазы.
  • Определить, произошла ли злокачественная трансформация клеток.
  • Определить прогноз для пациента.
  • Разобраться, поможет ли в данном случае таргетная терапия.
  • Определить, чувствительны ли опухолевые клетки к химиотерапии, лучевой терапии.

Как это работает?

Иммуногистохимическое исследование матки

Иммуногистохимия бывает прямой и непрямой. В первом случае используют один вид антител, которые должны вступить в связь с определенной молекулой-мишенью. Если молекула-мишень присутствует в ткани, и реакция произошла, опухолевая ткань окрашивается:

  • Чаще всего к антителу присоединяют фермент, например, пероксидазу. Этот фермент катализирует химическую реакцию, которая приводит к изменению цвета.
  • Иногда к антителу присоединяют флюоресцин или родамин, при этом окрашивание выявляют с помощью флюоресцентной микроскопии.
  • всего применяют непрямую иммуногистохимию. При этом используют два антитела. Одно соединяется с антигеном, второе — с полученным комплексом антиген-антитело. Маркер, который вызовет изменение цвета, связывают со вторым антителом.

Непрямой метод имеет некоторые преимущества:

  • Он обладает более высокой чувствительностью, потому что с одним первичным антителом (тем, которое связывается с белком-мишенью) может связаться несколько вторичных антител.
  • Исследование занимает немного времени: для того, чтобы произошла реакция, нужно примерно 3 часа.
  • Непрямая иммуногистохимия требует небольшого количества антител. Например, вторичное антитело, направленное на иммуноглобулины кролика, будет реагировать на любое первичное антитело «кроличьего» происхождения. Не нужно создавать много разных видов вторичных антител с окрашивающей или флуоресцентной меткой.

Как проводят исследование?

Для того чтобы выполнить иммуногистохимический анализ, нужно получить опухолевую ткань, то есть провести биопсию. В качестве материала можно использовать столбик ткани, полученный во время трепан-биопсии, фрагмент тканей или даже целый орган, удаленный во время операции.

Иммуногистохимическое исследование матки

Образец ткани фиксируют с помощью формальдегида (иногда используют метанол, ацетон и другие фиксаторы — это зависит от того, какой антиген нужно выявить, и реагирует ли он с теми или иными фиксаторами) и погружают в парафин. Парафинизация помогает законсервировать ткань, сохранить ее структуру на длительное время.

Затем ткань, помещенную в парафин, нарезают с помощью специального инструмента — микротома — на слои толщиной 3–5 мкм. Эти тонкие срезы помещают на стекло, покрытое, специальным клеем.

Некоторые образцы слишком чувствительны к реагентам, которые применяют во время вышеописанной процедуры. Их нельзя помещать в парафин. Такие ткани замораживают жидким азотом. Этим альтернативным методом пользуются редко, только в случае необходимости, так как у заморозки есть некоторые недостатки: она делает изображение под микроскопом не таким четким, требует специальных условий хранения образцов. Фиксацию ткани в таких случаях проводят уже после нанесения на стекло и размораживания, ацетоном или формальдегидом.

После того как срезы нанесены на стекло, из них нужно удалить весь парафин, иначе антитела не прореагируют с антигеном. Эта процедура называется депарафинизацией. Ее проводят с помощью ксилола. Затем выполняют еще некоторые подготовительные процедуры, чтобы антитела могли успешно прореагировать с нужными антигенами, и, наконец, проводят непосредственно иммуногистохимический анализ. Обработанную антителами ткань рассматривают под микроскопом, чтобы проверить, окрасилась ли она.

Какие молекулы-мишени выявляют во время иммуногистохимии?

Количество возможных мишеней измеряется сотнями. Перед исследованием врач должен понимать, что он ищет, и использовать соответствующие антитела. В онкологии мишенями являются опухолевые маркеры — вещества, которые в здоровых клетках отсутствуют вообще или присутствуют в значительно меньшем количестве. Вот некоторые примеры:

  • Рецепторы к эстрогенам и прогестерону помогают идентифицировать гормонально-позитивный рак молочной железы и разобраться, помогут ли женщине гормональные препараты.
  • Простатспецифический антиген (ПСА) имеет значение в диагностике рака простаты.
  • Альфа-фетопротеин — присутствует в гепатоцеллюлярной карциноме (рак печени).
  • Цитокератины помогают в диагностике рака и некоторых сарком (злокачественных опухолей соединительной ткани).
  • Фермент CD10 (CALLA) связан с карциномой почек, лимфобластным лейкозом.

Иммуногистохимическое исследование матки

Какова роль иммуногистохимии в современной онкологии?

Иммуногистохимический анализ помогает изучить характеристики злокачественной опухоли, которые не могут выявить другие методы диагностики. Зачастую это играет важную роль в уточнении диагноза и назначении правильного лечения. Врач может определить, какие комбинации препаратов будут наиболее эффективны для конкретного больного, иными словами, реализуется принцип персонализированного лечения. Зачастую это помогает улучшить результаты, подобрать эффективное лечение для пациентов, которым не помогает стандартная терапия.

Источник: www.euroonco.ru


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.